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轉錄組學研究

 轉錄組學研究簡單來說即從RNA水平研究基因表達的情況。以DNA為模版合成RNA的轉錄過程是基因表達的第一步,也是基因表達調控的關鍵步驟,在不同條件下或處理方法不時同,基因的表達隨之千變萬化,研究轉錄組譜可提供不同條件下基因的表達信息,并據此相應基因功能,進而揭示調節基因的作用機制。

轉錄組譜研究內容廣泛,如差異基因表達、選擇性可變剪切等,其中差異基因根據是否最終可被翻譯成蛋白質可分為mRNA和非編碼RNA,后者根據RNA的長度不同又分為miRNA、siRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、lncRNA等等,這些分子在RNA水平就能行使各自的生物學功能。

 轉錄學研究方法多種,但應用高通量芯片技術是一種快捷可靠的獲取轉錄組信息的方法。下圖是轉錄學研究的經典路線:



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我司采用Affymetrix表達譜芯片為廣大研究工作者提供多方位轉錄譜研究,更有高級、個性化數據分析為研究添磚加瓦,在后續驗證工作中,采用Quanti-Gene bDNA技術對中低通量基因的表達水平進行后續實驗驗證。


  • 全轉錄組芯片服務之Clariom D Solution——轉錄組水平解決方案

    僅限HumanMouse and Rat


    該系列具有前所未有的全面轉錄組覆蓋,提供更深、更廣、更精細的轉錄組信息檢測,適用于不同來源與性質的樣品,包含臨床來源的樣品,是轉化研究的首選工具。僅通過一次實驗,便可準確檢測編碼 RNA 與非編碼 RNA 在基因水平、外顯子水平的表達差異以及豐富全面的可變剪切信息。Clariom D Solution 為加速生物標記物探索與發現而設計,能夠以最快速度獲取可執行的結果,帶來全面的覆蓋率、穩定的可重復性、深度可執行的 RNA 標記物。


    快速準確的從 15 個數據庫超過 540,000 個轉錄本中發現鑒定疾病相關標記物

     

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    精心獨特的探針設計可信賴的從編碼
    RNA、非編碼RNA 中檢測基因水平、外顯子水平及可變剪切信息

    檢測其它技術方法無法檢測的低豐度和極低豐度轉錄本3.jpg

     

    此外,苜蓿作為豆科植物研究的模式生物,Affymetrix亦推出設計理念如Clariom D系列的對應產品——GeneChip@ Medicago Transcriptome Array

    GeneChip? Medicago transcriptome solution


          可檢測的物種亞型豐富

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          覆蓋度高


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  • 全轉錄組芯片服務之Clariom S Solution——基因水平解決方案

    僅限Human、Mouse and Rat


    為科研工作者提供快速、便捷以及靈活的方式去檢測轉錄組內的基因水平變化。特別設計針對覆蓋所有注釋明確的基因,兼容不同類型樣品包含臨床來源樣品,多種格式包含單張卡式芯片及高通量板式芯片,以滿足不同樣品通量研究需要。Clariom S Solution 是研究注釋明確基因的最好工具—簡單、高速、低成本。


    準確檢測覆蓋超過 20,000 個注釋明確基因的基因水平表達及信號通路變化,極速獲取結果


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    針對基因轉錄本保守序列精心設計探針提供真實基因水平信息

     

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    按需選擇合適格式滿足不同樣品通量研究需要,可每天處理 1 192 個樣品(新推出板式芯片)


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  • 全轉錄組芯片服務——Human Transcriptome Array 2.0 and其他物種類型

           模式生物來研究生物學問題的重要性不言而喻,我司采用Affymetrix st系列芯片為您提供相應表達譜分析服務。

    芯片特點

          這些模式和應用研究生物芯片提供了全轉錄組覆蓋,每個設計都是基于最新的轉錄組數據庫信息,提供了最高的探針覆蓋度 ( 全 長基因平均有 25 個探針 ),實現了全轉錄組水平表達變化的準確檢測,且分辨率和準確性高于市場上其他傳統的 3' 端表達譜芯 片。全轉錄組分析方法讓研究人員能夠檢測特定基因的多個轉錄本異構體,包括 3' 端檢測方法可能錯過的轉錄本,如可變剪切、 非 PolyA 轉錄本、多 PolyA 位點轉錄本以及截短的轉錄本。

    物種類型

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  • 3’IVT芯片服務

    GeneChip? PrimeViewTM 人類基因表達芯片

          PrimeViewTM 人類基因表達芯片以卡式芯片 (Cartridge) 形式提供了高質量的基因表達分析技術,實現了全基因組的基因表達分 析。PrimeViewTM 芯片表現出極高的性能,檢測信號強以及重復樣品的倍數變化關聯性好;它是一款研究藥物和疾病調控機制 的強大且經濟高效的工具。

    芯片特點

    1.  提供了出色的基因表達檢測的特異性和可重復性

    2. 通過每個轉錄本的多次獨立檢測產生可靠的結果注釋明確的序列為每組11個探針,其余的每組9個探針

    3. 提供了已注釋基因組的完整覆蓋—行業中最高的轉錄本覆蓋度,覆蓋Refseq中所有注釋明確的基因和轉錄本

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    芯片內容

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    其他物種類型的3’IVT芯片

     


    物種

    產品

    內容

    動物

    小鼠

    GeneChip? Mouse Genome 430 2.0 Array

    >39,000轉錄本

    大鼠

    GeneChip? Rat Genome 430 2.0 Array

    >30,000轉錄本

    瘧原蟲/按蚊

    GeneChip? Plasmodium/Anopheles Genome Array

    22,348探針組:

         5407(p.falciparum)

         16,941(A.gambiae)

    GeneChip? Bovine Genome Array

    >23,000轉錄本

    線蟲

    GeneChip? BC.elegans Genome Array

    >22,500轉錄本

    GeneChip? Canine Genome 2.0 Array

    >18,000 EST和mRNA轉錄本

    >20,000預測基因

    GeneChip? Chicken Genome Array

    32,773雞轉錄本684個禽類病毒轉錄本(含17種禽類病毒)

    果蠅

    GeneChip? Drosophila Genome 2.0 Array

    >18,500轉錄本

    恒河猴

    GeneChip? Rhesus Macaque Genome Array

    >47,000轉錄本

    GeneChip? Porcine Genome Array

    23,256轉錄本

    非洲爪蟾

    GeneChip? Xenopus laevis Genome 2.0 Array

    >29,900轉錄本

    熱帶爪蟾

    GeneChip? Xenopus tropicalis Genome Array

    >51,000轉錄本

    斑馬魚

    GeneChip? Zebrafish Genome Array

    >14,900轉錄本

    植物

    擬南芥

    GeneChip? Arabidopsis Genome ATH1 Array

    >24,000轉錄本

    大麥

    GeneChip? Barley Genome Array

    >22,500探針組

    柑橘

    GeneChip? Citrus Genome Array

    -30,171 Citrus 探針組

    -5023 SNP 探針組

    -7 Citruscontrol 探針組

    -2 Citrus tiling 探針組

    -46 Citruspathogen 探針組

    棉花

    GeneChip? Cotton Genome Array

    21,854轉錄本

    葡萄

    GeneChip? Vitis viniferaGrape Genome Array

    >15,700轉錄本

    玉米

    GeneChip? Maize Genome Array

    >14,850轉錄本

    苜蓿/中華根瘤菌

    GeneChip? Medicago Genome Array

    61,200探針組,含M.truncatula、M.sativa和S.meliloti

    楊樹

    GeneChip? Poplar Genome Array

    >56,000轉錄本

    植物

    水稻

    GeneChip? Rice Genome Array

    48,564粳稻(Japonica)轉錄本

    1,260秈稻(Indica)轉錄本

    大豆

    GeneChip? Soybean Genome Array

    58,463轉錄本

    -G.max 35,611

    -P.sojae 15,421

    -H.glycines 7,431

    甘蔗

    GeneChip? Sugar Cane Genome Array

    >7,500轉錄本

    番茄

    GeneChip? Tomato Genome Array

    >9,254轉錄本

    小麥

    GeneChip? Wheat Genome Array

    >55,000轉錄本

    微生物

    大腸桿菌

    GeneChip? E.coli Genome 2.0 Array

    20,366個基因

    E.coli Antisense Genome Array

    4,200個ORF

    >1,350基因間序列

    綠膿桿菌

    GeneChip? P.aeruginosa Genome Array

    -PAO1 strain的5,500   ORF

    -100基因間序列

    -其他菌株的117歌基因

    金黃色葡萄球菌

    GeneChip? S.aureus Genome Array

    -3,300 ORF

    -4,800基因間序列

    酵母

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  • 表達譜芯片送樣要求及數據分析、報告內容

    一、 樣本量要求

    總RNA:提供濃度不低于50 ng/ul,總量不小于2 μg的總RNA,OD260/280在1.7-2.1范圍內,28s和18s雙帶清晰可見。(請標明濃度和體積!)

    細胞:細胞樣本一般要求提供≥ 5×106個細胞數/ 張芯片樣品

    組織:應確保組織可以抽提出10μg的總RNA。

    血液:提供大于5ml血液樣本,確保純化出不小于10ug的RNA

    具體送樣要求詳見

     附件1:AFFY 芯片服務客戶須知 V2016.docx


    二、實驗流程

    3’IVT芯片實驗流程全轉錄本WT芯片實驗流程
    1. 總RNA純化1. 總RNA純化
    2. cDNA合成、cRNA 的生物素標記及cRNA 片段化2. cDNA合成、ss-DNA的片段化及生物素標記
    3. 基因芯片雜交反應、掃描3. 基因芯片雜交反應、掃描
    4. 數據處理和結果報告4. 數據處理和結果報告


     三、 數據分析流程

    圖片 1.png 

     

    四、報告內容

    3’IVT芯片服務實驗報告內容:

    原始數據CEL文件、芯片掃描原始圖像
    質檢報告RNA樣本質檢報告、芯片質檢報告
    數據分析結果RMA data:提供所有探針RMA均一化后的信號值及相應數據庫注釋等信息
    芯片兩兩比較或組間比較的結果:提供全部探針組在兩樣品中的表達變化的方向及程度和數據庫注釋等信息,并篩選出變化兩倍以上的探針組
    小提琴圖:為各芯片整體信號值相對分布圖
    散點圖或散點矩陣圖:用于評估兩組數據總體分布集中趨勢
    主成分分析圖:生物學重復樣本提供所有芯片表達模式相似性分析,并繪圖
    火山圖(optional):展示所有基因在倍數差異(Fold change)與P值分布上的特點,該分析需用戶設置重復樣本
    熱圖(optional):用于顯示不同組間基因表達水平,該分析需用戶設置重復樣本
    GSEA數據分析:根據Broad Insititute網站公布的Gene Set進行分析,不設定閾值,全局分析重要生物學通路,該分析需要設定重復樣本
    富集分析:基于篩選出的差異基因進行GO和Pathway富集分析
    參考資料芯片數據解讀說明性文件及實驗流程等   


    全轉錄本WT芯片服務實驗報告內容:

    原始數據CEL文件、芯片掃描原始圖像
    質檢報告RNA樣本質檢報告、芯片質檢報告
    數據分析結果RMA data:提供所有探針RMA均一化后的信號值及相應數據庫注釋等信息
    芯片兩兩比較或組間比較的結果:提供全部探針組在兩樣品中的表達變化的方向及程度和數據庫注釋等信息,并篩選出變化兩倍以上的探針組
    小提琴圖:為各芯片整體信號值相對分布圖
    散點圖或散點矩陣圖:用于評估兩組數據總體分布集中趨勢
    主成分分析圖:生物學重復樣本提供所有芯片表達模式相似性分析,并繪圖
    火山圖(optional):展示所有基因在倍數差異(Fold change)與P值分布上的特點,該分析需用戶設置重復樣本
    熱圖(optional):用于顯示不同組間基因表達水平,該分析需用戶設置重復樣本
    可變剪接分析(optional):計算所有可變剪接潛在位點發生可變剪接的可能性,該分析需用戶設置重復樣本。注:只有Clariom D solution及HTA2.0芯片可提供
    lncRNA cis調控:列出lncRNA上下游500kb范圍內可能與之存在調控關系的mRNA。注:只有Clariom D solution及HTA2.0芯片可提供
    GSEA數據分析:根據Broad Insititute網站公布的Gene Set進行分析,不設定閾值,全局分析重要生物學通路,該分析需要設定重復樣本
    富集分析:基于篩選出的差異基因進行GO和Pathway富集分析
    參考資料芯片數據解讀說明性文件及實驗流程等

    詳細結果形式及更多高級數據分析了參見附件2: 基因芯片服務數據分析手冊


  • 基于bDNA技術的QG/QGP服務

            Affymetrix公司旗下的Panomics開發出的Branch-DNA(bDNA)技術是一種獨特的三明治結構核酸雜交方法,該方法采用 bDNA 分子放大技術用于捕獲的目標 RNA 信號。使用QuantiGene產品,根據用戶選擇的基因定制探針,單重或多重定量分析基因表達水平及DNA拷貝數變化,也是基因芯片/NGS測序數據以及轉化研究中驗證生物標志物的理想工具。我司將該技術與Luminex平臺相結合,為廣大研究工作者提供核酸分析服務。

    技術特點

    ?    No miRNA, RNA and DNA isolation (無需抽提)

    ?    No reverse transcription (無需反轉錄)              

    ?    No PCR amplification (無需PCR擴增)

    ?    高達8000倍的信號放大,有效避免酶反應帶來的偏差

    ?    真正的多重定量——每孔可檢測多達80個指標而無交叉反應

    ?    應用廣泛,可檢測不同類型目標分子及樣本類型:mRNA, miRNA, ncRNA, DNA copy number, in situ, FFPE, blood......

    技術服務

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    1.     多基因檢測服務——QuantiGene? Plex 2.0系列產品

     服務特點

    -    同一反應檢測高達80種基因

    -    標準化平臺——96孔板形式與Luminex100相結合

    -    龐大的已驗證基因探針庫——超過15,000個基因的探針庫,可任意挑選混合,亦可定制探針

     

    2. 單基因檢測服務——QuantiGene? 2.0系列產品


    ①    裂解樣本,釋放出目標RNA

    ②    加入探針組:捕獲延伸探針的一部分與孔板底部結合,另一部分與目標RNA結合。“ZZ”型標記延伸探針與目標RNA結合,另外,封閉探針用于封閉一些位點提高特異性

    ③    加入信號放大前提、放大體、堿性磷酸酶標記的探針和底物

    ④    分光光度計檢測

    圖片 1.png


    另,還可以檢測miRNA的表達亮變化情況,探針設計原理見下圖: 

    圖片 1.jpg

    探針特點:

    ?    敏感度——>3,000 miRNA copies/assay well

    ?    特異性——One base

    ?    探針長度——25-mer;less,if miRNA length is less than 25


    QG 2.0QG Plex
    每孔檢測1種miRNA/RNA/DNA分子每孔可檢測3-80種mRNA/3-34種DNA分子
    主要應用領域:生物標志物的檢測、siRNA敲除定量、DNA拷貝數分析、miRNA定量、基因融合檢測主要應用領域:生物標志物、信號通路分析、DNA拷貝數變異、芯片和測序結果驗證
    檢測平臺:分光光度計檢測平臺:Luminex 100   

       

    樣本要求


    總RNA/DNA:提供量不小于1ug

    細胞:細胞樣本一般要求提供≥ 1×105 個細胞數/樣品

    FFPE切片:每個樣品約需切片面積250px2×5um厚度

    血液:提供500ulEDTA或檸檬酸抗凝血液樣本,-80度凍存/新鮮抗凝血液樣本


    服務流程


    1.樣品裂解
    2.探針標記的beads與樣品雜交
    3.洗滌染色,結果讀取
    4.數據處理和結果報告


    檢測報告

    1.   檢測的原始數據:提供各探針檢測數據。
    2.   樣品相對定量結果:提供探針相對標準品的相對定量結果信息。
    3.   QC Report文件:Luminex公司XPONENT3.1軟件給出的報告文件。
  • miRNA芯片服務


            眾所周知,miRNA的研究在過去幾年中發展相當迅速,我司采用Affymetrix最新開發的GeneChip? miRNA 4.0 Array為廣大客戶提供優質服務。

    芯片特點

    1.     100%覆蓋全新miRBase 20數據庫

    芯片內容


    miRBase

    Release 20

    Ensembl(BioMart   Export)

    Release 73

    snoRNAbase

    Version 3

    mirTarbase

    Release 4.5

     

    2.    物種涵蓋廣—可同時檢測203個物種的miRNA表達變化

    3.     樣本需求量低—僅需130ng的Total RNA

    4.     可檢測miRNA類型廣、數量多(下表僅列出人、大小鼠)

    種類

    Human

    Mouse

    Rat

    成熟miRNA

    2578

    1908

    728

    pre-miRNA

    2025

    1225

    490

    SnoRNA 、ScaRNA

    1996

    0

    0

     服務流

        3.jpg

    樣本要求

    總RNA:針對細胞來源樣本,提供濃度不低于500 ng/ul;針對組織來源樣本,提供濃度不低于100 ng/ul。總量均不可小于2 μg的總RNA,OD260/280在1.7-2.1范圍內,28s和18s雙帶清晰可見。(請標明濃度和體積!)

    細胞:細胞樣本一般要求提供1×107個細胞數/ 張芯片樣品

    組織:應確保組織可以抽提出10μg的總RNA

    血液:提供大于5ml血液樣本,確保純化出不小于10ugRNA

    數據分析

    數據歸一化及差異表達分析與mRNA芯片一致,下面僅介紹miRNA獨特的幾項數據分析內容

    1.  miRNA靶基因信號通路富集分析

         該分析展示用于差異miRNA的靶基因在所有Pathway中的分布趨勢,首先求得每個miRNA的靶基因,之后再統計這些靶基因在所有260多個Pathway中的位點分布情況,分箱(binned)后繪制熱圖,其中每一行代表一條miRNA,每一列代表Pathway,熱圖可以全面的展示這些miRNA的調控功能主要集中在哪些Pathway中,方便您將非編碼RNA與編碼RNA關聯起來研究。

    4.jpg

    2.  miRNA靶基因預測分析

          對于miRBase 20中新收入的miRNA,目前尚無數據庫收錄其對應靶基因信息,對于這類miRNA,可提供De Novo靶點預測分析服務。該預測算法整合miRanda與TargetScan算法的優點:

    *    miRNA與吧序列結合的2D簡圖,特別重要的互補區域以彩色標識出來

    *    結合點周圍的AU含量,AU越多,該區域越容易打開,利于AGO-miRNA復合物結合

    *    在UTR區域的相對位置,越靠近兩端,越可能是有效位點

    *    是否滿足TargetScan及miRanda算法的檢出閾值

    *    結合區域的序列保守性

    5.png

        結合區域的序列保守性 

      6.jpg

     

    3. 內源競爭性RNAceRNA)網絡分析

          mRNA與lncRNA質檢可以通過共享相同種類的miRNA分子,在大量重要的生物學通路中,都有ceRNA參與維護系統的穩定。

           下圖右側是我司提供的ceRNA網絡分析示例圖,展示出mRNA(綠色)/lncRNA(藍色)競爭結合miRNA的關系圖。

     7.jpg

     


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